Οι πρώτες δεκαετίες ύστερα από την κατάκτηση της Κύπρου από τους Οθωμανούς, το 1571, υπήρξαν εξαιρετικά δύσκολες για την Αδελφότητα της Μονής του Αγίου Νεοφύτου, αφού οι νέοι κατακτητές τήρησαν σκληρή στάση έναντι των Μονών του τόπου και κατάσχεσαν το μεγαλύτερο μέρος της μοναστηριακής κτημοσύνης.
Κατ᾽ αρχάς, σύμφωνα με σχετικό χρονογραφικό σημείωμα του έτους 1585, «ἀφάνισαν ταῦτα παντελῶς· μᾶλλον δέ ταύτην τήν ἁγίαν ἐγκλείστραν καί ἐγένετο μέγας κλαυθμός τε καί ὀδυρμός, τῶν μοναχῶν καί πᾶσι τοῖς ὀρθοδόξοις».
Η Μονή αποστερήθηκε τότε των αναγκαίων πόρων για τη συντήρηση Αδελφότητας, οπότε και εγκαταλείφθηκε για κάποιο χρονικό διάστημα. Στη συνέχεια, όμως, στις αρχές του 16ου αιώνα, με πρωτοβουλία του δυναμικού Ιερομόναχου και μετέπειτα Ηγουμένου Λεοντίου, επανδρώθηκε ξανά και σταδιακά ανέκτησε τα περιουσιακά της στοιχεία.
Ο Λεόντιος κατάφερε επίσης, ώστε η Μονή να τεθεί κάτω από την προστασία του Αρχιεπισκόπου Χριστοδούλουκαι να κηρυχθεί, το 1611, από την Ιερά Σύνοδο της Εκκλησίας της Κύπρου, με τη σύμφωνη γνώμη του Μητροπολίτη Πάφου Λεοντίου, Σταυροπηγιακή, με αποτέλεσμα να είναι ανεξάρτητη από τον τοπικό Επίσκοπο και τις ενδεχόμενες βλέψεις του στην κτηματική περιουσία της Μονής.
